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在ELISA实验中，组织样本的充分破碎和蛋白提取是决定实验成败的关键步骤。今天给大家分享几种主流破碎方法的详细操作条件和注意事项。

 

液氮研磨法

适用场景：

所有组织类型，尤其是坚韧组织（肌肉、皮肤、肿瘤）

操作条件：

用预冷的PBS(0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎（2-3mm小块，不要过大）。组织块放入研钵，倒入足量液氮浸泡，待液氮未完全挥发时快速用力研磨，直至呈细粉状。一般按1:9的重量体积比加入PBS，比如1g的组织样品对应9mL的PBS；然后用移液器反复吹打混匀，直至完全溶解。

Tips：

-研钵需预冷，防止组织解冻

-所有操作戴防冻手套和护目镜

- PBS必须提前4°C预冷，并添加蛋白酶抑制剂

 

冷冻研磨机法

适用场景：

所有组织类型；高通量样本处理

操作条件：

提前开启冷冻研磨机预冷，用预冷的PBS(0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎，分装至2mL离心管中，并加入2颗4mm磁珠。研磨参数设置60Hz频率，研磨45秒；若研磨不充分，可重复1~2次。
Tips：

- 必须使用专用耐低温离心管

- 磁珠大小根据组织量选择

- 避免过度研磨产热，间隔冷却很重要

 

 

超声破碎法

适用场景：

软组织（肝、脑、肾）或细胞样本的二次破碎

操作条件：

组织剪碎后，加入PBS制成粗匀浆液，设置超声功率200W（或仪器最大功率的25%），开3秒，停7秒，总时间3~5分钟。该操作全程冰上或冰浴操作，防止过热。

Tips：

- 探头不要接触管壁，避免气泡产生

- 超声间隔必须冰上降温
- 高功率、长时间超声会导致蛋白变性

 

反复冻融法

适用场景：细胞样本

操作条件：

将细胞悬液置于-80℃冰箱1小时或液氮中放置0.5小时，然后置于30℃水浴锅中轻微振荡使其迅速融化，此操作反复1-2次即可。

Tips：

- 冻融次数过多会激活蛋白酶，导致蛋白降解

- 解冻后必须充分混匀

- 破碎效率较低，坚韧组织不推荐

- 效果不佳时建议补加超声处理

 

通用关键参数

1. 离心参数

-速度：1500×g

-时间：10-15 min

-温度：2-8°C

2. 样本保存

-分装：提取后上清液按单次用量分装

-保存温度：-80°C长期保存

-避免反复冻融

 

实验干货的价值在于落地，希望今天分享的内容能帮大家少走弯路。但每个组织都有“脾气”，每个蛋白都有“个性”，文献参数只是起点，真正属于你实验的"金标准"，还需要大家在实践中微调验证。