技术专栏

？灵魂三问：
1.同一板子，复孔 OD 值差出 0.2？
2.梯度稀释越往下“飘”越狠？
3.标曲拟合 R²= 0.94，文章被审稿人一把打回？

先别急着骂试剂盒，90% 的“祸”可能藏在这里

一、试剂本身：源头失控，后面全废
♦ 标准品保存不当
标准品保存的温度不当（过高或过低），反复冻融或过期等导致其变性或降解，配制的标准品浓度不准确，尤其是高浓度点OD值下降更多，从而导致R²降低。又或者是标准品分装体积过小，容易蒸发导致高浓度点离散。

♦ 关键试剂变质或失效
包被抗原/抗体时的不均一，导致同一浓度在不同孔的结合差异大，OD值离散度增加。另外酶结合物、显色液、终止液等有沉淀或未按要求避光保存，导致高浓度孔显色不足，或低浓度孔显色异常等。

二、实验操作：手一抖，点飞走
★标准品粉末溶解不彻底，或溶解后未充分混匀，导致同一浓度标准品溶液中实际含量不同，造成孔间差异增大。
★标准品倍比稀释时操作不当，如移液器吸打不充分，蛋白吸附在枪头内壁；使用漩涡混匀或吸打速度过快气泡增加，导致的移液不准确。以及加样时错孔、漏孔都会破坏标准曲线的线性，导致R²降低。
★关键试剂如酶结合物、显色液、终止液等试剂的稀释未按照说明书比例进行配制，导致信号过强或过弱，偏离线性检测范围。
此外，洗板过度导致高浓度孔结合的酶被洗脱，OD值偏低；洗板不彻底又会造成非特异性显色使OD值偏高，从而导致标曲线性被破坏，R²自然高不了。

三、加样与孵育：板内微环境决定离散度
加样操作时间过长会导致标曲斜率“由陡变平”，孵育温度不准确（孵箱温度波动＞±1℃），孵育时间过长或过短，以及孵育时的边缘效应（边缘孔点蒸发导致OD值增加），造成整板CV增加，都会影响R²。

四、检测与计算：最后5min 掉链子
显色时间控制不当，时间过长底物耗尽，高浓度孔 OD 值趋于平缓，而低浓度孔OD值仍继续增加；终止反应不一致，终止液加样速度差异过大，增加了同一浓度标准品的OD值的差异；在酶标仪进行测定时，波长选错，未删除异常值等都会造成标曲的线性关系被破坏，从而导致R²降低。

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